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    血清胱抑素C測定的臨床意義及方法學進展

    日期:2011-08-08 00:00:00

    摘要 在腎小球濾過功能試驗中,血清肌酐、尿素及內生肌酐清除率是最常用的指標。由于以上指標尚存諸多不足,故人們一直在尋找新的反映腎小球濾過率變化的指標。胱抑素C是一種低分子量蛋白質,是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員之一,可由機體所有有核細胞產生,產生率恒定。循環中的胱抑素C僅經腎小球濾過而被清除,是一種反映腎小球濾過率變化的理想的內源性標志物。血清胱抑素C濃度在作為腎功能試驗時優于血清肌酐濃度。至于胱抑素C測定的方法學,已有快速、簡便且可自動化的“顆粒加強免疫比濁法”的最新報道,使血清胱抑素C測定的廣泛臨床應用成為可能。
    關鍵詞:胱抑素C;腎功能試驗;GFR;肌酐
    胱抑素C(Cystatin c)是一種低分子量蛋白質,Grubb等首先報道其血清濃度與GFR密切相關,可作為腎小球濾過功能指標[1]。近年來有關胱抑素C測定的臨床應用及方法報道日漸增多,本文就胱抑素C的結構與功能,作為反映腎小球濾過功能的內源性標志物及方法學進展作一綜述。
    1 胱抑素C的結構與功能
      胱抑素C,以前也被稱為γ-微量蛋白及γ-后球蛋白,是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質,分子量為13KDa,由120個氨基酸殘基組成,是一種分泌性蛋白質。細胞先合成一個帶信號肽的前體蛋白,編碼胱抑素C的基因位于人類第20號染色體,大約為4.3Kb,包含3個外顯子,基因上游45-50核苷酸處為“TATA盒樣”序列(ATAAAA)。胱抑素C基因5′-側翼區GC含量較高,轉錄起始位點上游400bp序列的G+C>70%,富含GC的“島”也包括外顯子1及內含子1、5′側的一部分,整個富含GC“島”約900bp,G+C含量為73%。此區域CpG/GpC比值接近于1,因此此區CpG是非甲基化的。在胱抑素C基因5′側翼1Kb序列中發現了2個“GC盒”(GGGCGG),此區也發現了增強子核心樣序列(GTGGAAGG)。由以上可見,胱抑素C基因5′側翼序列與“看家基因”的啟動子區具有相同的特性,即缺乏典型的“CAAT盒”、富含GC、有與轉錄因子Spl結合的“GC盒”。故可將胱抑素C基因看作是“看家基因”(house-keeping gene),即此基因在所有組織恒定持續地轉錄及表達。Northernx印跡也發現胱抑素C基因在所有的被觀察的組織均表達,包括腎、肝、胰、腸、胃、肺及胎盤[2]。
    由于胱抑素C是一種分泌性蛋白質,故廣泛地存在于各種體液中,如腦脊液、血液、唾液、精漿等。至于胱抑素C的確切生物學功能目前還了解不多,研究發現胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員之一,是目前發現的對組織蛋白酶B抑制作用最強的抑制物,對木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、組織蛋白酶H及L也有抑制作用,故胱抑素C的一個生理學功能可能是調節半胱氨酸蛋白酶的活性。胱抑素C基因突變可導致遺傳性胱抑素C淀粉樣血管?。℉CCAA),可發生腦動脈血管破裂,這是目前發現的直接與胱抑素C相關的臨床疾病。
    2 胱抑素C作為反映腎小球濾過功能的內源性標志物
      由于胱抑素C基因屬“看家基因”,能在幾乎所有的有核細胞表達,無組織學特異性,故機體胱抑素C產生率相當恒定。因胱抑素C是一種低分子量蛋白質,可經腎小球自由濾過,在近曲小管被重吸收并降解,腎臟是清除循環中胱抑素C的唯一器官,所以血清胱抑素C濃度主要由GFR決定,由此可見胱抑素C是一種理想的反映GFR變化的內源性標志物。
    grubb及Simonsen等[1]首先研究了血中低分子量蛋白質(β2-微球蛋白、視黃醇結合蛋白、胱抑素C)濃度與GFR(51Cr-EDTA清除率)的相關性,發現血清胱抑素C、β2-微球蛋白及視黃醇結合蛋白濃度的倒數與GFR的相關系數γ分別為0.75、0.70及0.39,血清肌酐濃度倒數與GFR的相關系數γ為0.73??梢婋滓炙谻是低分子量蛋白質中與GFR最相關的內源性標志物,甚至優于血清肌酐。血清β2-微球蛋白濃度由于在炎癥、腫瘤及免疫疾病時也可升高,故不是理想的GFR內源性標志物,視黃醇結合蛋白的代謝十分復雜,且部分與前白蛋白結合,不能自由經腎小球濾過,故血清視黃醇結合蛋白濃度的倒數與GFR相關性最差,不能作為GFR的內源性標志物。胱抑素C即使在炎癥狀態下,其產生率也不會改變,血清濃度受年齡、性別、疾病的病情變化的影響較小。Pergande等用99mTc-DTPA清除率作為腎小球濾過功能的“金標準”(<1.36ml/s為腎小球濾過功能受損,分析了胱抑素C、β2-微球蛋白及肌酐的血清濃度的診斷敏感性,結果發現它們診斷腎功能異常的敏感性分別為88.2%、64.7%及52.9%[3,4]。隨后Newman報道[5]血清胱抑素C、肌酐濃度診斷異常GFR的敏感性分別為78.1%及57.1%,各自濃度倒數與GFR(51Cr-EDTA清除率)的相關系數分別為:0.81、0.50。Kyhse andersen[6]及Filley[7]的最近臨床應用也表明血清胱抑素C濃度與GFR的相關性優于血清肌酐濃度。ROC(Receiver operating Characteristic)作圖分析發現,通過改變“分割限”(cutoff limit)使胱抑素C的診斷敏感性下降至70%時,其診斷特異性仍可達75%;而通過改變血清肌酐濃度的“分割限”,使其診斷敏感性下降至50%時,才能獲得100%的特異性,使敏感性增加至100%時,其特異性接近于零。各自ROC曲線下面積相差顯著(P<0.001),說明胱抑素C的診斷準確性明顯優于血清肌酐。
    表1 各種測定方法比較

    方法
    檢測限μg/L
    CV%
    測定時間
    參考范圍x±SD(范圍),mg/L
    分析樣品數
    RID
    300
    11
    38h
    1.3±0.26(0.72~1.7)
    46
    EIA
    30
    10 ~12
    16h
    1.1±0.42(0.63~2.5)
    30
    RIA
    1.3
    n.d.
    16~21h
    0.96±0.20(0.6~1.7)
    100
    FIA
    1
    n.d.
    lor3h
    n.d.
     
    EIA
     
    n.d.
    4.5h
    1.1±0.15
    20
    EIA
    1.9
    4~5
    5h
    0.75±0.65(≤20歲)
    85
    1.34±0.95(>20歲)
    189
    0.195
    4~8
    1.5h
    1.25±0.22(0.86~1.7)
    50
    EIA
    0.9
    3~9
    2h
    1.78±0.26(女)
    33
    2.14±0.31(男)
    33
    PETIAm
    150
    2.0~3.2
    7min
    (0.61±1.21)
    27
    PETIA
    27
    3~5
    5min
    <1.25
     
    PENIA
    170
    3~5
    6min
    (0.64~1.04)
    30

    3 血清胱抑素C測定的方法學
      由于血清中胱抑素C濃度較低,故其測定方法需較高的分析靈敏度及特異性。Lofberg等首先用單向免疫擴散法(RID)及酶免疫測定法(EIA)對胱抑素C含量進行測定,按照目前的標準,當時報道的這兩種方法不僅費時,而且檢測限也差(分別為300,30μg/L)。隨后,又有較簡單且更靈敏的放射、熒光及各種酶免疫測定(RIA、FIA及EIA)的方法報道,以改善胱抑素C測定的可靠性。 1993年Pergande等[3]報道了一種夾心酶免疫測定方法,其檢測限雖然很低(0.9μg/L),但測定時間仍較長,無法常規應用,更無法用于急診測定。以上各種測定方法均屬非均相測定方法,很難自動化,因此限制了胱抑素C的廣泛臨床應用。膠乳免疫測定是一種均相測定方法,在膠乳顆粒上包被抗體,與抗原結合時顆粒發生凝集,此方法很容易自動化。Kabanda等于1994年報道的測定胱抑素C的膠乳顆粒凝集法是一種顆粒計數免疫測定法[8]。Kyhse andersen等[6]于同年報道了一種顆粒增強透射免疫比濁法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA),使胱抑素C測定的時間縮短至5min左右,且可在自動生化分析儀上進行,使胱抑素C測定的常規應用成為可能。隨后,Newman等也報道了類似方法[9]。1997年,Finney等報道了一種能快速自動測定胱抑素C的顆粒增強散射免疫比濁法(particle-enhanced nephelometric immunoassay, PENIA),其測定結果與PETIA法相關性良好[10]。各種胱抑素C測定方法的比較見表1。
      從表1可見,單純就檢測靈敏度而言,RID法最差,而EIA、RIA及FIA法[1114]均優于PETIA及PENIA法。由于RIA法存在放射性污染,FIA法需昂貴的儀器,以及RIA、FIA、EIA法測定時間長,且不能全自動化,無法用于臨床大批量標本的測定。PETIA及PENIA法雖然檢測靈敏度差些,但仍可達150μg/L左右,遠遠低于健康人血清胱抑素C濃度的下限值,可滿足臨床需要;這兩種測定方法基本上不受血紅蛋白、膽紅素、類風濕因子、甘油三酯的影響,回收率可達95%~109%,批內及批間變異系數均較?。ǎ?.5%);加上這兩種方法可全自動化,故在血清胱抑素C測定的常規臨床應用中可首選PETIA或PENIA法。
    各位研究者所報道的血清胱抑素C濃度的參考范圍有一定的差異,這一方面是由測定方法不同所致,另一方面與所用胱抑素C標準品的來源不同有關,現應用的胱抑素C標準品有3種類型:①從人尿中純化的胱抑素C;②純化的人類胱抑素C,并用重組胱抑素C定值;③重組胱抑素C,并溶于馬血清。Pergande等用一種尿蛋白標準品,發現血清胱抑素C濃度存在性別差異,其它研究者利用其它標準品時未發現性別差異。因此,應制定有關標準品制備的統一標準,以便進行方法比較及參考范圍的建立。
    4 小結
    在腎臟疾病治療中已涌現出許多新方法,如抗炎藥物、腎移植及透析等。在應用這些方法的過程中,腎移植后排斥反應的監測及腎毒性藥物腎毒性監測等。均需一種快速、簡單且能準確地反映GFR變化的指標[15]。無論從理論上還是實踐中,血清胱抑素C的測定均優于血清肌酐的測定,加上能自動化的檢測的PETIA及PENIA方法的建立,已使胱抑素C的廣泛臨床應用成為可能。在今后的實踐中,應注意測定方法的標準化問題;觀察血清胱抑素C濃度在不同腎臟疾病狀態下的變化規律;應在更大的人群內測定血清胱抑素C濃度,以分析是否存在年齡及性別相關的差異;從而最終確定胱抑素C的敏感性及特異性。
     
    參考文獻(省略)
     
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